Todos en
alguna ocasión hemos dicho aquello de “alguien se ha hecho un zumo con mi media
naranja” y es que aún hay quien piensa que existe la persona perfecta para cada
cual. Como bioquímico que soy, opino de forma diferente. Creo que el amor sigue
una cinética enzimática de diferente orden con diferentes sustratos, que son
nuestras parejas. Por supuesto existe un sustrato ideal con el que la velocidad
es máxima, pero en esas ocasiones, por desgracia, la reacción acaba pronto si
el sustrato es limitado.
No pienses
mal, los “bio-estudiosos” en realidad somos unos románticos y nos empeñamos en
emparejar todo. Constantemente buscamos aquella proteína que encaja mejor con
una proteína dada, la concentración que va mejor con mi enzima, la temperatura
a la que mi sistema está agustito, etc. De hecho, estamos tan empeñados en esto
del amor molecular que nos hemos creado un sistema para ver que proteínas
interaccionan entre ellas y cuales no. Es, por así decirlo, el “eDarling” de la
biología molecular. Se trata del sistema “Two yeast Hibrid” o “Sistema de dos
híbridos en levaduras”. Al igual que pasa con “eDarling” en Internet, el
sistema de dos híbridos es un método artificial porque usa proteínas de bacterias
en levaduras (eucariotas), pero es in vivo, y eso tiene muchas ventajas.
Pronto
hablaré de las conversaciones que se pueden tener en el interior de una célula
(y no, no se habla de política ni de crisis), pero de momento baste decir que
cuando una célula recibe una señal del exterior (ya sea de peligro, de amistad
o de indiferencia), se produce una serie de cambios y mensajes que viajan al
interior de la célula. Estos cambios son comunicados de unas proteínas a otras
que se “cuentan” que está pasando, para que el mensaje siga su camino y llegue
hasta los estamentos (orgánulos o zonas) de respuesta. Esto es tan sencillo
como cuando uno está en la cama con su pareja, siente frío en su piel, y se lo
dice a su pareja, ¿Para que lo sepa y esté informada? No, para que le pase un
poco de manta porque se la ha quitado durante la noche.
Pues bien,
no siempre pero si la mayoría de las veces, para que una proteína hable con
otra deben interaccionar. Se hablan como si estuvieran sordas y ciegas, es
decir, necesitan tocarse para poder entenderse (al contrario que muchas
parejas, que sin estar ni sordas ni ciegas, se tocan y no se entienden). ¿Y eso
como lo estudiamos en biología molecular? (lo de las proteínas que
interaccionan, no lo de las parejas), pues con el sistema de dos híbridos en
levaduras. Hay otros métodos como la cromatografía de afinidad o la co-inmuno
precipitación, que tienen sus pros y sus contras, pero hoy no hablaré de ellos.
Existen
microscopios y formas de marcaje que nos permiten ver la distribución de dos
proteínas en células vivas, incluso podemos ver que dos proteínas co-localizan
en una zona determinada. Pero que dos proteínas estén en el mismo sitio y al
mismo tiempo, no significa que interaccionen directamente (igual que cuando vas
a una fiesta y ves al chic@ que te gusta, estáis los dos allí, pero no interaccionáis).
El sistema
es algo complejo, pero intentaré resumirlo lo mejor posible.
La mayoría
de los factores de transcripción (los obreros que activan la expresión de los
genes) son modulares, es decir, que poseen un dominio de activación de la
transcripción (Activation Domain, AD) y por otro lado un dominio de unión o
interacción con el ADN (Binding Domain, BD. Este es el realmente específico y
que se une a un promotor). Estos dominios pueden funcionar si se encuentran
próximos el uno al otro, incluso si no están directamente unidos, pero sí lo
suficientemente cerca.
Lo que se
hace pues es separar el AD y el BD para construir dos híbridos. El primero de
ellos se unirá a una proteína que yo conozco bien, y a la que le quiero buscar
la pareja (recordad que esto es amor puro y duro) a la que llamaremos X. X será
unida al dominio de unión BD del activador GAL4. En segundo lugar, haré toda
una batería de uniones a una colección de proteínas candidatas Y, que irán
unidas al dominio de activación AD de GAL4.
De este
modo, los dominios de activación y de unión están separados y no pueden
funcionar, es decir, no puede hacer que se transcriba el GAL4 y por tanto la
levadura en cuestión no se puede alimentar de Galactosa. Pues bien, ahí esta la
clave, utilizaremos la unión (o no unión) de las proteínas X e Y, para acercar
de forma correcta a AD y BD. De modo que, si mi proteína X, interacciones con
mi proteína Y, los dominios de activación y de unión estarán tan cerca que
podrán llevar a cabo la activación de la transcripción de GAL4.
Claro está
que estas uniones no se llevan a cabo con celo o pegamento, hace falta
codificar cada una de las uniones en un plásmido, es decir, construir una
secuencia de nucleótidos que codifique para la expresión de una proteína
artificial que será la unión de BD-X o bien de AD con uno de los Y de la
colección que quiero estudiar. Además, en ese plásmido tengo que meter una cosa
mas; información para la síntesis de aminoácidos. Por ejemplo, Triptófano y
Leucina. Obviamente, todo esto habrá que meterlo en una cepa especial de
levadura que no puede sintetizar por si misma ninguno de los aminoácidos.
Hay cepas de
levadura que están modificadas genéticamente de forma que son incapaces de
sintetizar ciertos nutrientes, es decir, son defectivas para la biosíntesis de
ciertos componentes como aminoácidos o ácidos nucleicos (ladrillos de las
proteínas y el DNA/RNA respectivamente). Cuando estas cepas de levadura se
cultivan en un medio defectuoso en uno de esos “ladrillos”, no son capaces de
sobrevivir. A estas cepas de levadura se les llama AUXOTROFAS. Además, estas
cepas pueden incorporar DNA de fuera en forma de plásmido (DNA foráneo
vehiculizado en un plásmido). En este caso, usaremos una cepa de levadura que
es Auxotrofa para triptófano y leucina. Y además la levadura tendrá en su
interior dos conStrucciones, el gen de levadura his3 y el gen bacteriano
LacZ, ambos bajo dominio de un promotor GAL. Es por tanto una levadura
auxotrofa para Triptófano, Leucina e Histidina y defectuosa en los promotores
Gal. Posee además dos construcciones bajo control de un promotor Gal.
Creo que ya
lo tenemos todo para comenzar. Debemos de ayudar a la levadura a que se coma
los dos plásmidos que le hemos preparado, le ponemos un medio de cultivo
adecuado (sin leucina ni triptófano claro) y aquellas que sean capaces de
crecer, significará que han incorporado mis dos plásmidos y por tanto mis dos construcciones
(BD-X y AD-Y).
Seguro que a
estas alturas ya te has liado (sigues pensando en las relaciones como cinéticas
enzimáticas ¿verdad?). No te preocupes, vamos a hacer un resumen de lo que
tenemos, lo que nos hace falta y como funciona.
Ingredientes:
2/3 de Whisky canadiense
1/3 de vermut seco
Gotas de angostura
1
aceituna verde
Corteza
de limón
¡Ahora que
tenemos nuestro coctel Manhattan preparado, vayamos a explicar resumidamente el
sistema de dos híbridos en levadura!
La levadura
que hemos escogido es auxotrofa para Leucina y Triptófano, por tanto, para que crezcan,
debemos poner en el medio de cultivo esos dos aminoácidos. Una vez que ha
crecido, le introducimos nuestros dos plásmidos, (Uno de ellos con lo
suficiente para producir Triptófano y el otro con lo suficiente para producir
Leucina). Y volvemos a cultivar nuestras levaduras, esta vez en el medio no
ponemos ni triptófano ni leucina.
Si la
levadura es capaz de crecer en este segundo medio sin triptófano ni leucina,
significará que ha incorporado a su interior los dos plásmidos, lo que le
permite sintetizar por si sola los dos aminoácidos. Como los plásmidos llevan
además las construcciones de BD-X y de AD-Y, cuando la levadura comience a usar
los plásmidos para sintetizar los aminoácidos, a su vez se comenzarán a
sintetizar las dos construcciones que ahora se traducirán a proteína, tal y
como queríamos al principio. Aquí viene lo bueno del experimento:
Las
levaduras que han podido crecer en un medio sin Triptófano ni Leucina, y que
suponemos que ahora expresan nuestras dos fusiones, las cultivamos en un medio
que además no lleva Histidina. Recuerda que la levadura en su genoma lleva lo
suficiente para fabricar Histidina, pero no posee el factor de transcripción
para sintetizarla. Lo que si tiene es un promotor bajo el sistema de
transcripción GAL4 formado por BD y AD. Como he dicho antes, para que BD y AD
funcionen, deben interaccionar las dos proteínas X e Y que llevan fusionadas.
Por tanto, si X e Y interaccionan, AD y BD están cerca y activan la
transcripción de Histidina, y por tanto, esa levadura podrá crecer en un medio
sin Histidina.
Aún así, hay
otra construcción en la levadura, la de la beta-Galactosidasa ¿Verdad?. Pues
bien, la misma interacción X-Y que permite sintetizar histidina, además activa
a una enzima, la Beta-Galactosidasa, que transforma un compuesto, el X-Gal, en
un compuesto de color azul. Por tanto, si veo que las levaduras se ponen
azules, significan que hay interacción entre X e Y.
Es
importante decir que esta técnica nos permite además medir o cuantificar la
intensidad de unión de una proteína con otra midiendo la actividad
beta-galactosidasa. De igual modo y mediante mutaciones puntuales podemos
encontrar el sitio exacto de unión de las distintas proteínas e incluso
comprobar genotecas al completo, para ello sólo tenemos que cultivar la
levadura con el plásmido que lleva BD en un medio sin triptófano. Luego,
introducimos toda una batería de plásmidos con AD y diferente proteínas de una
colección y cultivamos en medio sin Triptófano, Leucina ni Histidina, y las que
produzcan colonias azules, serán proteínas que se unen a la mía X. Luego por
simple electroforesis podemos saber cual era esa proteína.
Casi se me olvida
decirlo. Para quien no lo sepa, cuando hablamos de levaduras, hablamos de Saccharomyces
cerevisiae, la que se usa para hacer pan y cerveza. Y es que como en todo
buen inicio de una relación, sobre todo si es amorosa, la cerveza no puede
faltar.
Termino recomendando
esta canción de la magnífica y siempre sexy Donna Summer, fallecida
recientemente a los 63 años. Espero que
la disfrutéis.
Esta entrada participa en la XIII
Edición del Carnaval de Biología, alojado por Marisa Alonso
Núñez (@lualnu10
para los amigos) en Caja
de Ciencia.
ATG
ResponderEliminarMuy buena síntesis de este sistema. Creo que te comenté que me pasé por aquí para repasar el examen de hongos ;)
TAA
EuGene, hombre no te pongas a estudiar de aquí. Así luego me sacas las notas que me sacas en los exámenes. jejeje.
ResponderEliminarMuchas gracias por el comentario tio.