18 mayo, 2012

“Two yeast Hibrid” o el amor molecular


Todos en alguna ocasión hemos dicho aquello de “alguien se ha hecho un zumo con mi media naranja” y es que aún hay quien piensa que existe la persona perfecta para cada cual. Como bioquímico que soy, opino de forma diferente. Creo que el amor sigue una cinética enzimática de diferente orden con diferentes sustratos, que son nuestras parejas. Por supuesto existe un sustrato ideal con el que la velocidad es máxima, pero en esas ocasiones, por desgracia, la reacción acaba pronto si el sustrato es limitado.

No pienses mal, los “bio-estudiosos” en realidad somos unos románticos y nos empeñamos en emparejar todo. Constantemente buscamos aquella proteína que encaja mejor con una proteína dada, la concentración que va mejor con mi enzima, la temperatura a la que mi sistema está agustito, etc. De hecho, estamos tan empeñados en esto del amor molecular que nos hemos creado un sistema para ver que proteínas interaccionan entre ellas y cuales no. Es, por así decirlo, el “eDarling” de la biología molecular. Se trata del sistema “Two yeast Hibrid” o “Sistema de dos híbridos en levaduras”. Al igual que pasa con “eDarling” en Internet, el sistema de dos híbridos es un método artificial porque usa proteínas de bacterias en levaduras (eucariotas), pero es in vivo, y eso tiene muchas ventajas.

Pronto hablaré de las conversaciones que se pueden tener en el interior de una célula (y no, no se habla de política ni de crisis), pero de momento baste decir que cuando una célula recibe una señal del exterior (ya sea de peligro, de amistad o de indiferencia), se produce una serie de cambios y mensajes que viajan al interior de la célula. Estos cambios son comunicados de unas proteínas a otras que se “cuentan” que está pasando, para que el mensaje siga su camino y llegue hasta los estamentos (orgánulos o zonas) de respuesta. Esto es tan sencillo como cuando uno está en la cama con su pareja, siente frío en su piel, y se lo dice a su pareja, ¿Para que lo sepa y esté informada? No, para que le pase un poco de manta porque se la ha quitado durante la noche.

Pues bien, no siempre pero si la mayoría de las veces, para que una proteína hable con otra deben interaccionar. Se hablan como si estuvieran sordas y ciegas, es decir, necesitan tocarse para poder entenderse (al contrario que muchas parejas, que sin estar ni sordas ni ciegas, se tocan y no se entienden). ¿Y eso como lo estudiamos en biología molecular? (lo de las proteínas que interaccionan, no lo de las parejas), pues con el sistema de dos híbridos en levaduras. Hay otros métodos como la cromatografía de afinidad o la co-inmuno precipitación, que tienen sus pros y sus contras, pero hoy no hablaré de ellos.

Existen microscopios y formas de marcaje que nos permiten ver la distribución de dos proteínas en células vivas, incluso podemos ver que dos proteínas co-localizan en una zona determinada. Pero que dos proteínas estén en el mismo sitio y al mismo tiempo, no significa que interaccionen directamente (igual que cuando vas a una fiesta y ves al chic@ que te gusta, estáis los dos allí, pero no interaccionáis).

El sistema es algo complejo, pero intentaré resumirlo lo mejor posible.

La mayoría de los factores de transcripción (los obreros que activan la expresión de los genes) son modulares, es decir, que poseen un dominio de activación de la transcripción (Activation Domain, AD) y por otro lado un dominio de unión o interacción con el ADN (Binding Domain, BD. Este es el realmente específico y que se une a un promotor). Estos dominios pueden funcionar si se encuentran próximos el uno al otro, incluso si no están directamente unidos, pero sí lo suficientemente cerca.


Lo que se hace pues es separar el AD y el BD para construir dos híbridos. El primero de ellos se unirá a una proteína que yo conozco bien, y a la que le quiero buscar la pareja (recordad que esto es amor puro y duro) a la que llamaremos X. X será unida al dominio de unión BD del activador GAL4. En segundo lugar, haré toda una batería de uniones a una colección de proteínas candidatas Y, que irán unidas al dominio de activación AD de GAL4.

De este modo, los dominios de activación y de unión están separados y no pueden funcionar, es decir, no puede hacer que se transcriba el GAL4 y por tanto la levadura en cuestión no se puede alimentar de Galactosa. Pues bien, ahí esta la clave, utilizaremos la unión (o no unión) de las proteínas X e Y, para acercar de forma correcta a AD y BD. De modo que, si mi proteína X, interacciones con mi proteína Y, los dominios de activación y de unión estarán tan cerca que podrán llevar a cabo la activación de la transcripción de GAL4.


Claro está que estas uniones no se llevan a cabo con celo o pegamento, hace falta codificar cada una de las uniones en un plásmido, es decir, construir una secuencia de nucleótidos que codifique para la expresión de una proteína artificial que será la unión de BD-X o bien de AD con uno de los Y de la colección que quiero estudiar. Además, en ese plásmido tengo que meter una cosa mas; información para la síntesis de aminoácidos. Por ejemplo, Triptófano y Leucina. Obviamente, todo esto habrá que meterlo en una cepa especial de levadura que no puede sintetizar por si misma ninguno de los aminoácidos.

Hay cepas de levadura que están modificadas genéticamente de forma que son incapaces de sintetizar ciertos nutrientes, es decir, son defectivas para la biosíntesis de ciertos componentes como aminoácidos o ácidos nucleicos (ladrillos de las proteínas y el DNA/RNA respectivamente). Cuando estas cepas de levadura se cultivan en un medio defectuoso en uno de esos “ladrillos”, no son capaces de sobrevivir. A estas cepas de levadura se les llama AUXOTROFAS. Además, estas cepas pueden incorporar DNA de fuera en forma de plásmido (DNA foráneo vehiculizado en un plásmido). En este caso, usaremos una cepa de levadura que es Auxotrofa para triptófano y leucina. Y además la levadura tendrá en su interior dos conStrucciones, el gen de levadura his3 y el gen bacteriano LacZ, ambos bajo dominio de un promotor GAL. Es por tanto una levadura auxotrofa para Triptófano, Leucina e Histidina y defectuosa en los promotores Gal. Posee además dos construcciones bajo control de un promotor Gal.


Creo que ya lo tenemos todo para comenzar. Debemos de ayudar a la levadura a que se coma los dos plásmidos que le hemos preparado, le ponemos un medio de cultivo adecuado (sin leucina ni triptófano claro) y aquellas que sean capaces de crecer, significará que han incorporado mis dos plásmidos y por tanto mis dos construcciones (BD-X y AD-Y).

Seguro que a estas alturas ya te has liado (sigues pensando en las relaciones como cinéticas enzimáticas ¿verdad?). No te preocupes, vamos a hacer un resumen de lo que tenemos, lo que nos hace falta y como funciona.

                 Ingredientes:
                            2/3 de Whisky canadiense
                            1/3 de vermut seco
                            Gotas de angostura
                            1 aceituna verde
                            Corteza de limón

¡Ahora que tenemos nuestro coctel Manhattan preparado, vayamos a explicar resumidamente el sistema de dos híbridos en levadura!

La levadura que hemos escogido es auxotrofa para Leucina y Triptófano, por tanto, para que crezcan, debemos poner en el medio de cultivo esos dos aminoácidos. Una vez que ha crecido, le introducimos nuestros dos plásmidos, (Uno de ellos con lo suficiente para producir Triptófano y el otro con lo suficiente para producir Leucina). Y volvemos a cultivar nuestras levaduras, esta vez en el medio no ponemos ni triptófano ni leucina.

Si la levadura es capaz de crecer en este segundo medio sin triptófano ni leucina, significará que ha incorporado a su interior los dos plásmidos, lo que le permite sintetizar por si sola los dos aminoácidos. Como los plásmidos llevan además las construcciones de BD-X y de AD-Y, cuando la levadura comience a usar los plásmidos para sintetizar los aminoácidos, a su vez se comenzarán a sintetizar las dos construcciones que ahora se traducirán a proteína, tal y como queríamos al principio. Aquí viene lo bueno del experimento:

Las levaduras que han podido crecer en un medio sin Triptófano ni Leucina, y que suponemos que ahora expresan nuestras dos fusiones, las cultivamos en un medio que además no lleva Histidina. Recuerda que la levadura en su genoma lleva lo suficiente para fabricar Histidina, pero no posee el factor de transcripción para sintetizarla. Lo que si tiene es un promotor bajo el sistema de transcripción GAL4 formado por BD y AD. Como he dicho antes, para que BD y AD funcionen, deben interaccionar las dos proteínas X e Y que llevan fusionadas. Por tanto, si X e Y interaccionan, AD y BD están cerca y activan la transcripción de Histidina, y por tanto, esa levadura podrá crecer en un medio sin Histidina.

Aún así, hay otra construcción en la levadura, la de la beta-Galactosidasa ¿Verdad?. Pues bien, la misma interacción X-Y que permite sintetizar histidina, además activa a una enzima, la Beta-Galactosidasa, que transforma un compuesto, el X-Gal, en un compuesto de color azul. Por tanto, si veo que las levaduras se ponen azules, significan que hay interacción entre X e Y.



Es importante decir que esta técnica nos permite además medir o cuantificar la intensidad de unión de una proteína con otra midiendo la actividad beta-galactosidasa. De igual modo y mediante mutaciones puntuales podemos encontrar el sitio exacto de unión de las distintas proteínas e incluso comprobar genotecas al completo, para ello sólo tenemos que cultivar la levadura con el plásmido que lleva BD en un medio sin triptófano. Luego, introducimos toda una batería de plásmidos con AD y diferente proteínas de una colección y cultivamos en medio sin Triptófano, Leucina ni Histidina, y las que produzcan colonias azules, serán proteínas que se unen a la mía X. Luego por simple electroforesis podemos saber cual era esa proteína.

Casi se me olvida decirlo. Para quien no lo sepa, cuando hablamos de levaduras, hablamos de Saccharomyces cerevisiae, la que se usa para hacer pan y cerveza. Y es que como en todo buen inicio de una relación, sobre todo si es amorosa, la cerveza no puede faltar. 




Termino recomendando esta canción de la magnífica y siempre sexy Donna Summer, fallecida recientemente a los 63 años.  Espero que la disfrutéis.



Esta entrada participa en la XIII Edición del Carnaval de Biología, alojado por Marisa Alonso Núñez (@lualnu10 para los amigos) en Caja de Ciencia.