23 febrero, 2013

Jerga de Laboratorio V

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La gente que trabaja en el laboratorio somos especialmente dados a abusar de la jerga de nuestra profesión (y no me refiero a un trozo de tela gruesa y tosca). El tipo de lenguaje que en el laboratorio nos puede llegar a ser familiar pero que saca de sus casillas al resto del mundo porque en ocasiones más que jerga se convierte en jerigonza.

Hace tiempo que no publico nada de esta serie de modo que ya es hora. Os recuerdo que el conocimiento es acumulativo y os recomiendo que leáis las entradas anteriores para que todo quede mas claro y no nos perdamos en el jardín de la Jerga de Laboratorio. 

Hoy nos introducimos en un laboratorio de Microbiología para ver algunas palabras curiosas de la jerga del laboratorio. 

Supongo que la mayoría sabe lo que son las bacterias y nos podemos hacer una idea de lo que comen y respiran, ¿No?. Todo el mundo sabe que las bacterias comen cerebros de conformistas y conspiranoicos y respiran oxígeno. 

Pues ni mucho menos (aunque lo de los conspiranoicos puede ser). Hay bacterias que respiran Oxígeno, pero otras pueden respirar azufre, óxido de hierro, nitrógeno o casi cualquier cosa que se puedan imaginar. Cuando hablamos de que "respiran" nos referimos al proceso fisiológico en el cual existe un aceptor de electrones último al final de la cadena transportadora. En el caso de los organismos aeróbios como nosotros ese aceptor último es el oxígeno, pero no es así en todas las bacterias (y no todas las bacterias que viven en presencia de oxígeno lo utilizan para tal fin).

En el laboratorio casi siempre trabajamos con bacterias aerobias o microaerobias (requieren oxígeno pero en concentraciones menores a la presente en la atmósfera) que se suelen alimentar de azúcares como la glucosa, la fructosa, manosa, etc. Por tanto, les solemos poner potingues ricos en estas cosas. Ya os comenté que los medios de cultivo deben de tener una fuente de Nitrógeno, Oxígeno, Carbono, vitaminas, minerales, agua, etc. Para cada bacteria irán bien una concentraciones u otras de unos compuestos u otros además de los requerimientos especiales de cada una (algún metal, vitamina, aminoácido, etc). 

Transformar

Las transformaciones que observamos en el laboratorio son menos impresionantes, pero nos valen igual para publicar. 

Cuando hablamos en biología molecular de transformar una bacteria, nos estamos refiriendo a la alteración genética de la misma que se produce como resultado de la absorción directa, incorporación o expresión del material genético exógeno. Ese material genético no solo lo ponemos nosotros. En la naturaleza se dan las transformaciones entre bacterias del medio ambiente de forma natural. En el laboratorio lo único que hacemos es aprovechar esa capacidad de las bacterias para conseguir algo (que la bacteria exprese una proteína, me haga muchas copias de un plásmido, conserve la secuencia dentro para hacerse resistente, etc. ). Bueno, lo único no. En realidad utilizamos las bacterias como máquinas productoras o reproductoras... ¡Vamos, que las usamos de fotocopiadoras y no pagamos ni derechos de autor ni leches fritas!

Si por ejemplo necesito muchas copias de una secuencia de ADN determinada, puedo hacer una PCR (reacción en cadena de la polimerasa mediante la cual somos capaces de hacer muchas copias de una misma secuencia) o bien en alguna ocasiones y sobretodo debido al tamaño del fragmento que queremos copiar, podemos vehiculizar el fragmento (meterlo dentro de un plásmido o un cósmido), cortando el vector con enzimas de restricción y ligando con una ligasa, introducirlo en una bacteria y aprovechar su maquinaria de síntesis de ADN para tener muchas copias del plásmido en cuestión. Luego solo tengo que liberar de nuevo el fragmento con la misma enzima de restricción, lo corremos en un gel de agarosa donde elijo el fragmento del tamaño adecuado y listo. 

En otras ocasiones nos interesa que el plásmido con nuestra secuencia se quede dentro y no solo se copie sino que además se exprese (se traduzca a proteína, regule algún mecanismo o algo). En el caso de las proteínas, podemos conseguir grandes cantidades de la proteína de interés para hacer los ensayos necesarios para conocer más detalles sobre ella. Antes de la aparición de esta tecnología había que procesar grandes cantidades del organismo de donde proceda la proteína (imagínate si es una proteína humana... no quedaría bonito "procesar" 3 o 4 personas para conseguir proteína suficiente).

Biólogo molecular procesando muestra humana antes de la aparición de la tecnología de vectores

Pero una bacteria no se deja transformar así como así. Son de hecho bastante cabezonas y no se puede introducir ADN tan fácilmente como os lo estoy explicando aquí (Por mucho que les pese a todos los contrario a los transgénicos, el ADN no se moviliza fácilmente). 

Debemos someter a las bacterias a algo así como un curso intensivo de lavado de cerebro (como ir a un colegio religioso durante 10 años... pero en un solo día)

Bacterias competentes

Aquí tenemos a otra bacteria competente y con estudios que se tiene que ir del país porque no hay trabajo (forma parte del llamado movimiento de Fuga de Flagelos)

Cerca del 1% de las bacterias conocidas son capaces de incorporar fragmentos de ADN bajo condiciones de laboratorio (y son muchas mas las que lo pueden hacer en su medio natural) gracias a su maquinaria genética específica. Sin embargo son muchas más las que no lo hacen y por tanto debemos recurrir a técnicas que convenzan a las bacterias... Digamos que de alguna forma las amedrantamos bien de forma física o bien de forma química. Es lo que se denomina "hacer competentes unas bacterias" (se sobreentiende que es una competencia artificial). 

La competencia artificial no está codificada en su material genético, ellas no saben que lo pueden hacer.

Competentes químicas - El proceso pasa por hacer crecer un cultivo hasta una cantidad determinada, se las poner en frío y se introducen en el medio cationes divalentes como el calcio (que prepara a las membranas para que sean permeables al ADN plasmidial). Luego al calentarlas a 40ºC esos poros se abren y el ADN en forma de plásmido puede introducirse de una forma bastante eficiente. No funciona bien con el ADN lineal ya que las bacterias poseen enzimas capaces de degradarlo. 

A veces las células se ponen cabezotas y no se dejan transformar. Para esos casos tenemos técnicas mas convincentes como es la Electroporación


Aquí tenemos al bueno de Homer electroporándose un six pack de birras

La electroporación consiste en provocar un aumento momentáneo pero muy significativo de la conductividad eléctrica y la permeabilidad de la membrana celular. Eso se hace aplicando un campo eléctrico externamente. ¡Vamos, que con un chispazo así me dejo transformar hasta yo!

Diagrama de una cubeta de electroporación. Si os fijáis la suspensión de células está justo en medio de dos electrodos y la única región por donde puede pasar la electricidad es a través del líquido en el que nadan nuestras células. 

Una vez que tenemos nuestro fragmento de ADN en el interior de la bacteria las dejamos que crezcan en un medio rico y con todo el oxígeno que quieran (ya han cumplido su misión y ahora se merecen el descanso del ganador). 

Pero obviamente no nos quedamos ahí y seguimos trabajando con ellas. 

En algunas ocasiones el fragmento de  ADN que le hemos introducido codifica genes para resistencia a un antibiótico, por tanto en el medio donde sembramos ahora estas bacterias transformadas tiene ese antibiótico. Aquellas bacterias que no se han transformado no puede vivir en un medio con el antibiótico. Nos puede interesar en algunas ocasiones por tanto contar las colonias que tenemos. 

En la imagen, Bióloga inexperta contando colonias

Placa con colonias aisladas (aquí se pueden contar bien, pero créanme que no siempre es tan fácil)

A la hora de contar colonias debemos tener en cuenta el factor de dilución, es decir, si cogemos un cultivo bacteriano y ponemos directamente 100 microlitros en una placa, lo más probable es que haya tantas unidades formadoras de colonias (bacterias capaces de formar una colonia) que no seamos capaces de distinguirlas y por tanto observemos un cesped homogéneno en el que es imposible contar nada. 


Por tanto se suelen hacer diluciones seriadas (cogemos una parte de cultivo y lo diluimos 10 veces, homogeneizamos y volvemos a repetir la operación tantas veces como sea necesario). Luego contamos las UFC y lo multiplicamos por el factor de dilución. 

Si tenemos 2.536 colonias en una placa en la que hemos puesto 100 microlitros, tendremos 25.360 UFC/mililitro. Si esos 100 microlitros provienen de una dilusión 1/10, multiplicamos por 10 y por tanto teníamos 253.600 UFC/mililitro. 

Contar Calvas



No es que a los científicos nos de por buscar mujeres con poco pelo, nada mas lejos de la realidad.

En ocasiones queremos saber como afecta un virus o un plásmido suicida a nuestra población bacteriana. En esos casos no buscamos colonias aisladas sino calvas aisladas (zonas donde mi bacteria no crece porque se ha lisado por acción de por ejemplo, un virus). 

Aquí se puede observar las calvas producidas por fagos lisogénicos. Poro mejor que os paséis por el blog de Micro gaia para una explicación más completa. 

Y por hoy yo creo que es suficiente. Espero que os vayáis poco a poco haciendo la filosofía de trabajar con ADN recombinante y con bacterias o al menos os familiaricéis con la terminología para que cuando os hable un friki amigo que se dedica a la investigación no os deje cazando moscas (que a veces también tenemos que hacerlo).


Ideas de conceptos aportadas por @DrLitos, @Banchsinger y @bioamara